| Parameters | Description | Value |
|---|---|---|
| CleanData(%) | >90% | |
| Adapter(%) | <6% | |
| LowQuality(%) | <10% | |
| polyA(%) | <0.01% | |
| N(%) | <10% | |
| AF_Q20(%) | >90% | |
| AF_Q30(%) | >80% | |
| sample rawdata(bp) | >5400000000 | |
| ATCG pos|(i+1)-i| | <0.05 | |
| pos i |A-T|(|C-G|) | <0.04 | |
| Mapped_Reads(%) | <50% | |
| Total_Mapped(%) | 人鼠：参考基因组比对率低于85%给与警示；其他物种：参考基因组比对率低于60%给与警示 | >80% |
| Multiple_Mapped(%) | Multiple map>20%给与警示，阈值调整为35% | <35% |
| Total_Mapped(%) max-min | <10 | |
| sequenced_Total_Genes(%) | 基因检出率低于40% | >40% |
| sequenced_Total_Genes(%)max-min | <10 | |
| Annot [Pathway] | >8% | |
| Annot [Description] | >70% | |
| Annot [GO] | >35% | |
| pair all diff | >100 | |
| newgene/allgene | ||
| pearson | 计算样本之间的pearson相关系数,对表达值采用 log2(TPM+1)处理，再计算相关系数 | >0.8 |
| Top 3 gene max-min ratio | 样本间Top3基因count占总count的比例差值>15%给与警示 | >15% |
| updown ratio | 上调基因数目/下调基因数目<0.05或上调基因数目/下调基因数目>20时给与警示 | >=0.05, <20 |
| AF_GC | 各个样本GC%含量差值>4%给与警示 | >4% |
| rawdata | 每个样本 6 G数据，并考虑到生物学实验的不确定性，合同承诺最终各样本平均数据量不低于目标数据量的90%，每个样本数据量不低于目标数据量的70%，平均Q20≥90%，平均Q30≥80%。 | mean>90% |
| log10(median) | 比较同组样本中生物学重复样本的log10（FPKM）的中位数值，当生物学重复样本中log10（FPKM）的中位数极大值-极小值>0.32时，给与警示 | >0.32 |
| base pos | 碱基分布曲线中，A,G,C,T四条线，横坐标相邻位置的两个点差值不超过5% | >0.5% |
| A-T | 碱基分布曲线中|A%-T%|>4%给与警示（不考虑reads的前20bp） | >4% |
| exon | 与exon比对率低于50%时给与警示 | <50% |
| C-G | 碱基分布曲线中|G%-C%|>4%给与警示（不考虑reads的前20bp） | >4% |
# sample distribution
index <- seq(28,277)
for (test in seq(1,5)){
# EBVn 50 50 .. 50 50
# 选小一点，这样可以把样本异质性凸显出来
# print(sample_size)
sample_size <- 50
cur_mat <- EBV_dat_num[,c(seq(1,27),sample(index, sample_size))]
degs_analysis_draw(cur_mat, d)
# break
}
# 散点图
num_degs <- data.frame(
down = c(2939,2932,2996,3609,3396),
up = c(1199,1197,1217,1329,1234)
)
# basic scatterplot
scatter_plot <- ggplot(num_degs, aes(x=down, y=up)) +
geom_point()
scatter_plot
` # sample distribution `
index <- seq(28,277) for (test in seq(1,5)){ # EBVn 50 50 .. 50 50 # 选小一点，这样可以把样本异质性凸显出来 # print(sample_size) sample_size <- 50 cur_mat <- EBV_dat_num[,c(seq(1,27),sample(index, sample_size))] degs_analysis_draw(cur_mat, d) # break } # 散点图 num_degs <- data.frame( down = c(2939,2932,2996,3609,3396), up = c(1199,1197,1217,1329,1234) ) # basic scatterplot scatter_plot <- ggplot(num_degs, aes(x=down, y=up)) + geom_point() scatter_plot
通过抽样测试发现：
DEGs总数稳定：
| EBVn样本量 | 下调基因数 | 上调基因数 | 总DEGs数 |
|---|---|---|---|
| 50 | 3823 | 1357 | 5180 |
| 100 | 4005 | 1411 | 5416 |
| 150 | 4400 | 1355 | 5755 |
| 200 | 4320 | 1387 | 5707 |
| 250 | 4416 | 1340 | 5756 |
上下调比例始终失衡：
lfcShrink函数收缩log2倍数变化值，减少高表达基因对差异倍数的影响基本概念 - PCA（Principal Component Analysis）即主成分分析，是一种常用的数据分析方法。它的主要目的是通过线性变换将原始数据转换为一组新的变量，这些新变量被称为主成分。主成分是原始变量的线性组合，并且它们是按照方差大小依次排列的。 - 比如，假设有一组二维数据点$(x_1,y_1),(x_2,y_2),\cdots,(x_n,y_n)$，PCA的目标就是找到两个新的变量（主成分），使得这些数据点在新的变量表示下能够最大程度地保留数据的方差信息。
PCA图主要用来降维和分类，PC1 和 PC2 实际上是基于这些计算得到的特征向量所确定的新的坐标轴方向，它们分别代表了数据在不同维度上的最大方差方向，也就是能最大程度地区分样本的方向。通俗一点的理解就是，PCA 的作用就是找到一些新的坐标轴，将这些原本在高维空间的样本点投影到这个由 PC1 和 PC2 构成的二维平面上，这样我们就可以通过观察这些样本点在这个二维平面上的分布情况，比如它们之间的距离远近等，来判断样本之间的相似程度或者是否能分成不同的类别等。
所以问题来了：怎么利用PCA去除离群样本？PCA不好要不要重测？
注意注意！PCA只能用来相对地看样本之间的差异，如果没有对照，只有重复的三个处理样本，PCA可能会放大不重要的差异！
# 清除当前环境中的所有对象，确保没有残留变量干扰
rm(list = ls())
# 加载必要的包
library(ggplot2)
# 读取 data.csv 文件，添加错误处理
data <- read.csv("data.csv", row.names = 1)
head(data)
# wt1 wt2 wt3 ko1 ko2 ko3 kd1 kd2 kd3
# MSTRG.10004 2.639 1.849 2.087 0.149 0.506 0.816 0.382 0.571 0.736
# MSTRG.10008 1.420 1.341 1.350 0.564 0.390 0.682 0.248 0.540 0.637
# MSTRG.10158 1.470 1.655 1.081 0.000 0.771 0.528 0.136 0.000 0.787
# MSTRG.10160 0.699 0.611 0.483 1.014 0.724 0.478 0.219 0.307 0.580
# MSTRG.10171 0.558 1.025 0.221 0.896 0.790 0.649 1.983 2.475 2.239
# MSTRG.10179 0.565 0.545 0.573 1.392 1.717 1.368 1.334 0.831 1.215
data_t = t(data)
dim(data_t)
# 过滤掉全为0的行和列
data_t <- data_t[,colSums(data_t)>0]
data_t <- data_t[,apply(data_t, 1, var)!=0]
# 执行主成分分析
pca_result <- prcomp(data_t, scale. = TRUE)
# 计算主成分的百分比解释方差
pca_percentage <- (pca_result$sdev^2 / sum(pca_result$sdev^2)) * 100
# 可视化
library(factoextra)
fviz_eig(pca_result, addlabels = TRUE)
fviz_pca_ind(pca_result,
col.ind = rownames(data_t), mean.point = F,
addEllipses = T, legend.title = "Groups"
)
# 或者ggplot2
p <- ggplot(
pca_result$x,
aes(x = PC1, y = PC2, color = rownames(data_t))
) +
geom_point() +
labs(
title = "PCA Plot",
x = "Principal Component 1",
y = "Principal Component 2",
color = "Group"
) +
# 添加坐标轴
xlab(paste0("PC1 (", round(pca_percentage[1], 2), "%)")) +
ylab(paste0("PC2 (", round(pca_percentage[2], 2), "%)"))
p
Upset图不仅可以展示差异基因，也能展示富集通路。
# Remove all objects from the workspace
rm(list = ls())
# Load the UpSetR library
library(UpSetR)
# Read the data from the files. Make sure the file paths are correct.
# Also, consider using read.table if the files are not tab-delimited.
k1 = read.delim("CS-vs-CT.path.xls", header = T)
k2 = read.delim("FS-vs-FT.path.xls", header = T)
# Check the column names of k1
head(k1)
# KEGG_A_class KEGG_B_class
# 1 Environmental Information Processing Signaling molecules and interaction
# 2 Organismal Systems Development and regeneration
# 3 Organismal Systems Immune system
# 4 Environmental Information Processing Signal transduction
# 5 Environmental Information Processing Signaling molecules and interaction
# 6 Human Diseases Infectious disease: parasitic
# Pathway
# 1 Cytokine-cytokine receptor interaction
# 2 Osteoclast differentiation
# 3 IL-17 signaling pathway
# 4 TNF signaling pathway
# 5 Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor
# 6 Malaria
# Create a list of the Pathway columns from k1 and k2
k = list(k1_Pathway = k1$Pathway, k2_Pathway = k2$Pathway)
# Create the UpSet plot with more customization
upset(fromList(k),
order.by = "freq",
main.bar.color = "gray",
matrix.color = "black",
mainbar.y.label = "Intersection Size",
sets.bar.color = "lightblue",
text.scale = c(1.3, 1.3, 1, 1, 2, 0.75),
number.angles = 30,
point.size = 3.5,
line.size = 2
)
将差异基因分为上调和下调基因后分别进行富集分析，可以更清晰地揭示生物过程在不同调节方向上的变化。分开的富集分析结果在解释时更加直观。对于我们来说，能够直接聚焦于上调或下调基因所涉及的特定生物学过程和通路，便于发现关键的基因集和功能变化。单独分析上调和下调基因可能会忽略它们之间的协同作用。在许多生物学过程中，基因的上调和下调是相互关联的，共同调节细胞功能或生物体的表型。将所有差异基因一起进行富集分析则可以考虑基因表达变化的整体情况。这种方法适用于研究基因表达变化的总体趋势和对生物系统的综合影响。
]]>WGCNA（ Weighted correlation network analysis）译为加权基因共表达网络分析，是一种经常用于基因组和系统生物学研究中的网络分析方法。WGCNA对不同样本中的基因关联模式进行描述，以鉴定出样本中和表型高度协同变化的基因集，或者说模块。
比如，可以研究不同组织或不同物种之间的模块保存程度（module preservation）。
模块保存程度统计信息（Preservation Statistic）旨在量化参考数据集和测试数据集之间模块保存情况。WGCNA R包中的函数modulePreservation用于计算不同数据集之间的模块保存统计信息。modulePreservation函数用法可以参考网页：https://rdrr.io/cran/WGCNA/man/modulePreservation.html。
以往的模块保存程度统计信息可以分为四大类：
modulePreservation函数，一般会统计以下列表的统计信息，其中Type列为每类统计量的类别，Network列为每类统计量使用的网络类型，*input列表示需要输入的数据类型，输入数据需要以下类别：
转录组或芯片数据在数据库中存在大量类似的研究结果，那么这些结果之间的相容性如何？WGCNA中modulePreservation函数用于阐述不同实验结果的基因表达模式的关联；
不同物种之间基因表达模式的分析也是多数文章的研究方向，WGCNA中modulePreservation函数同样也适用于阐述不同物种的基因表达模式的关联，比如人与黑猩猩基因表达模块之间的基因保存性，类似的分析有很多，比如人与牛，人与猪等。
以下命令用于演示在黑猩猩数据集中人脑共表达模块的保存情况。
启动R之后，设置工作目录并加载所需的包。
# Display the current working directory
getwd()
# If necessary, change the path below to the directory where the data files are stored.
# "." means current directory. On Windows use a forward slash / instead of the usual
workingDir = "."
setwd(workingDir)
# Load the package
library(WGCNA);
# The following setting is important, do not omit.
options(stringsAsFactors = FALSE)
首先下载数据，存放在本地目录中，表达矩阵数据存放在在Dataset 1 (network construction).csv.bz2中。
# data input
file = bzfile("Dataset 1 (network construction).csv.bz2")
dat1 = read.csv(file, header=T)
表达矩阵包含36个样本，每一行对应一个基因/探针，每一列对应一个样本或辅助信息，我们需要删除辅助信息，并转置表达矩阵用于后续分析。我们只保留BrainvariantH列>0的基因/探针。
dim(dat1)
names(dat1)
datExpr=data.frame(t(dat1[dat1$Brain_variant_H>0,2:39]))
indexHuman=c(19:36)
indexChimp=c(1:18)
现在我们设置多组表达数据和相应的模块颜色。
# Number of data sets that we work with
nSets = 2
# Object that will contain the expression data
multiExpr = list()
multiExpr[[1]] = list(data = datExpr[indexHuman, ])
multiExpr[[2]] = list(data = datExpr[indexChimp, ])
# Names for the two sets
setLabels = c("Human", "Chimp")
# Important: components of multiExpr must carry identificating names
names(multiExpr) = setLabels
# Display the dimensions of the expression data (if you are confused by this construct, ignore it):
lapply(multiExpr, lapply, dim)
最后一条命令的输出确认有两个表达数据集，每个数据集包含18个样本中4000个基因的表达测量值。
注意multiExpr的结构：它是一个列表，每个输入数据集必须包含一个称为data的组件并且包含表达数据。外部列表必须具有适当的名称，以便表达式数据可以与我们接下来创建的模块标签匹配。
WGCNA分析中，通过构建共表达矩阵，计算基因间的相似性，确定基因模块，通常用不同的颜色来代表模块，即每个模块中的基因对应同一种color，方便后续的模块可视化。后续会分享该部分的相关内容。
HumanChimp-OldhamAnalysis-colorHuman-colorChimp-inNetwork.RData中包含黑猩猩表达矩阵中每个基因的模块颜色信息（colorChimp）以及人表达矩阵中每个基因的模块颜色信息（colorHuman）。
# 加载从网络分析获得的模块标签，并创建一个列表。
x = load("HumanChimp-OldhamAnalysis-colorHuman-colorChimp-inNetwork.RData") # Create an object (list) holding the module labels for each set:
colorList = list(colorHuman, colorChimp)
# Components of the list must be named so that the names can be matched to the names of multiExpr
names(colorList) = setLabel
注意，multiExpr的名称和multiColor（即这里的colorList）的名称必须对应。
这里使用modulePreservation进行模块保存性计算，运行后将结果保存为Rdata，下次可直接加载，节省时间。
system.time( {
mp = modulePreservation(multiExpr, colorList,
referenceNetworks = c(1:2),
loadPermutedStatistics = FALSE,
nPermutations = 200,
verbose = 3)
} )
save(mp, file = "HumanChimp-HumanSpecific-modulePreservation.RData")
该函数输出的是一个嵌套列表，包括quality，preservation，accracy，permutationDetails，referenceSeparability和testSeparability，每个列表分别包含4或5个组成部分，包含：
每个列表包含Z，log.p，log.pBonf（可选的q值），accuracy中包含的observedOverlapCounts和observedFisherPvalues被构造为2级列表，其中外部组件对应于参考集，内部组件对应于测试集。例如，preservation$observed[[1]] [[2]]包含用于保存测试集中参考集的密度和保存性等保存统计信息，1是参考集，2是测试集。
ref = 1 # Select the human data as reference
test = 2 # Select the chimp data as test
statsObs = cbind(mp$quality$observed[[ref]][[test]][, -1], mp$preservation$observed[[ref]][[test]][, -1])
statsZ = cbind(mp$quality$Z[[ref]][[test]][, -1], mp$preservation$Z[[ref]][[test]][, -1])
我们看主要输出Zsummary评分。
print(signif(statsZ[, "Zsummary.pres", drop = FALSE],2))
一般文献中认为：
查看不同物种的不同模块之间的overlap基因数与overlap pvalue。
overlap = cbind(mp$accuracy$observedCounts[[1]][[2]], mp$accuracy$observedFisherPvalues[[1]][[2]])
print(overlap)
输出结果的前8列为overlap基因数，后8列为 overlap pvalue。